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技术文章

转基因动物

此文为译文,可能会不通顺,原文地址users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html
被刻意插入其基因组中携带外源基因的转基因动物是一种。
的外源基因构建重组DNA方法。除了基因本身的DNA通常包含的其它序列,使
要掺入到DNA的主机和
要正确表达的宿主细胞。
生产转基因绵羊和山羊,表达外源蛋白在牛奶。
现在,转基因鸡中的“白”的鸡蛋,能够合成的人类蛋白质。
这些动物最终应被证明是有价值的用于人类治疗的蛋白质来源。 2000年7月,研究人员从团队生产多莉报道在生产转基因羊,转基因已插入的基因组中的特定网站,并运作良好的成功。 [详细]

转基因小鼠探索许多生物学问题提供了工具。

举个例子:
不能正常小鼠感染脊髓灰质炎病毒。他们缺乏的,在人类,作为病毒的受体的细胞表面分子。因此,正常小鼠不能作为一种廉价的,容易操作的模型,用于研究疾病。然而,脊髓灰质炎病毒受体的转基因小鼠表达人的基因
由脊髓灰质炎病毒,甚至可以感染
发展麻痹和其他特征性病理改变人类的疾病。
被广泛用于生产转基因小鼠的两种方法:
转化生长在组织培养中的所需DNA的胚胎干细胞( ES细胞) ;
所需基因注射到一个受精的小鼠卵的原核。
胚胎干细胞的方法(方法“1” )
胚胎干细胞( ES细胞)是从小鼠囊胚的内细胞团( ICM )收获。他们可以在培养基中生长,并保留充分发挥其潜力,产生所有细胞的成熟动物,包括其配子。链接到胚胎干细胞的讨论。
 
1。让你的DNA
利用重组DNA方法,构建DNA分子含有
你的愿望(例如,胰岛素基因)的基因;
载体DNA上,使被插入到宿主的DNA分子的分子;
启动子和增强子序列,以使基因表达的宿主细胞。
2。变换的ES细胞的培养
暴露在培养细胞中的DNA ,所以,有些人会纳入。
3。选择成功的转化细胞。 [方法]
4 。这些细胞注射到小鼠囊胚的内细胞团( ICM ) 。
5 。胚胎移植
准备假孕小鼠(雌性小鼠交配与输精管结扎的男性) 。交配的刺激引出所需的荷尔蒙的变化,使她的子宫接受。
胚胎转移到她的子宫。
希望他们成功植入和发育成健康的幼崽(不超过三分之一的意志) 。
6 。测试她的后代
从尾组织中取出一小片,并检查其所需基因的DNA 。不超过10-20%,将拥有它,他们将基因杂合子。
7。建立转基因株
队友两个杂合子小鼠和1 ,将在4个转基因纯合子筛选他们的后代。
交配会发现这些转基因品系。
该原核方法(方法“2” )
1。方法1 ,准备你的DNA
2。变换受精卵
收获新鲜受精卵的精子头部已经成为一个原核之前。
与你的DNA注入雄性原核。
当原核形成二倍体受精卵细胞核融合,使受精卵分裂有丝分裂,形成2 - 细胞胚胎。
3。胚胎植入假孕养母继续方法1 。
为例。
 
此图片(礼貌RL的布林斯特的RE锤)显示转基因小鼠与的正常littermate (左) (右) 。的巨型鼠标开发转化的重组DNA分子中含有从受精卵:
人生长激素的基因
一个强大的小鼠基因启动子
在一些转基因小鼠的血清中的生长激素水平比对照组高几百倍。
随机与靶向基因插入
早期用于基因插入的载体,并放置基因(从1至200份)在基因组中的任何地方。但是,如果你知道一些特定基因的DNA序列,它是可以设计替换该基因的载体。置换基因可同时由
恢复功能的突变体的动物或
击倒一个特定位点的功能。
在这两种情况下,有针对性的基因插入需要
所需基因
neor ,一个基因,该基因编码的酶失活的抗生素新霉素及其亲属,类似药物G418 ,这是致命的哺乳动物细胞;
TK,一个基因,该基因编码的胸苷激酶,磷酸化的酶,核苷类似物更昔洛韦。 DNA聚合酶不能歧视产生的核苷酸插入到新鲜DNA复制的非功能性核苷酸。所以的更昔洛韦杀死细胞包含tk基因。
 
第1步
对待文化载体DNA的胚胎干细胞的准备。
结果:

大多数细胞不能占用向量,这些细胞就会被杀死,如果暴露在G418 。
在几个细胞:将载体在基因组中随机插入。在随机插入,整个向量,包括tk基因,插入到宿主的DNA 。这些细胞是抗G418但杀害更昔洛韦。
仍然较少的细胞发生同源重组。在载体中的DNA序列的舒展找到同源序列在宿主基因组中,宿主的DNA ,这些同源序列之间的区域取代相当于区域。
第2步
培养在培养基中, G418和更昔洛韦的细胞混合物。
经G418杀死细胞(多数)未能采取矢量。
丙氧鸟苷,其中随机插入载体的细胞被杀死的(因为它们含有tk基因) 。
这留下了人口通过同源重组(丰富的几千倍)的细胞转化。
第3步
注入这些小鼠囊胚的内细胞团。
基因敲除小鼠:他们教给我们什么?
如果是无功能的的置换基因(图中的* ) (一个“空”等位基因)的杂合的转基因小鼠交配会产生非功能性基因的菌株的“基因敲除小鼠的纯合子(在该位点的基因的两个副本已被“淘汰” )。

基因敲除小鼠功能(s )的基因,这些基因突变株以前没有发现有价值的工具。研究基因敲除小鼠出现两个概括:
往往出奇不受其缺陷的基因敲除小鼠。许多基因是不可缺少的。小鼠基因组中出现有足够的冗余,以补偿缺少一个单一的双等位基因。
大多数基因多效性。它们以不同的方式在不同组织中表达,并在不同的时间在发展。
组织特异性基因敲除小鼠
“看家”基因,同时在所有的发展阶段,在所有类型的细胞中表达的其他基因正常表达的,只有某些类型的细胞中,由适当的信号(例如一种激素的到来)打开时。

连结细胞特异性基因表达的讨论。

为了研究这种基因,人们可能会认为上述的方法将工作。然而,事实证明,只表现在某些成人组织的基因在胚胎发育过程中仍可能是至关重要的。在这种情况下,动物不会存活足够长的敲除基因进行研究。

幸运的是,现在与转基因小鼠技术可以在一个特定的基因只有一种类型的细胞中被淘汰。
酶Cre / loxP系统
一个名为P1噬菌体感染大肠杆菌,产生的一种酶 - 指定CRE - 削减其DNA适合包装成新鲜的病毒颗粒的长度。所有它遇到一个对指定的序列的loxP序列, Cre重组酶切割的病毒DNA 。所有的两个loxP位点之间的DNA被删除,和其它DNA连接在一起(这样的酶是重组酶) 。

使用“方法1 ” (见上文) ,小鼠可以使转基因
基因编码的酶Cre附着发起人将被激活,只有当它是由同一打开这种类型的细胞的独特功能( S)所需的其他基因的转录因子的约束;
“目标”的基因,其功能之一是进行研究,两侧loxP序列。
在成年动物中,
这些细胞
接收信号(如激素或细胞因子的到来)
打开生产所需的转录因子
激活基因的发起人,其产品所需要的某类细胞
Cre基因的转录,也将开启。其蛋白质,将消除“目标”基因进行研究。
所有其他细胞会缺乏所需的转录因子绑定到Cre重组酶启动子(和/或任何增强剂) ,使靶基因仍然完好。
其结果是:鼠标淘汰只有某些细胞与特定基因。

敲小鼠
的Cre / loxP系统也可以被用来

删除,阻止基因转录的DNA序列。 “目标”的基因可以被实验者的愿望,在某些细胞中,或在特定的时间开启。
研究者希望研究一种新的基因取代鼠标的自己的基因之一。
这样的转基因小鼠中被称为“敲入”老鼠。

转基因绵羊和山羊
直到最近,转基因羊引入随机插入基因组中的工作,往往不佳。然而,在2000年7月,成功在转基因插入到一个特定的基因位点进行了报道。该基因是人类基因为α1-抗胰蛋白酶,两只动物表达了人的蛋白质在牛奶中的大量。

这是怎么做的。

羊生长在组织培养中的成纤维细胞(结缔组织细胞)治疗与载体的DNA片段包含这些:

羊COL1A1基因同源的2个地区。这个基因编码的I型胶原蛋白。 (没有在人类遗传性疾病导致成骨不全症)。
此位点的选择,因为纤维母细胞分泌大量的胶原蛋白,因此,人们期望的基因在染色质方便。

新霉素抗性基因,以帮助隔离这些细胞成功地将矢量。 [链接技巧]
人类基因编码α1-抗胰蛋白酶。
有些人继承两个非或缺乏运作这种蛋白质的基因。其产生的水平低或不存在产生的疾病的α1-抗胰蛋白酶缺乏( A1AD或ALPHA1 ) 。其主要症状是损坏到肺部(有时肝脏) 。

β-乳球蛋白基因的启动子站点。这些牛奶中产生细胞促进激素驱动基因表达。
核糖体结合位点的β-乳球蛋白的mRNA的翻译效率。
当时成功转化细胞
融合与去核羊蛋描述的方法[链接]
植入一只母羊的子宫(母羊) 。
几个胚胎存活,直到他们的出生,和两个年幼的羔羊住了一年多。
用激素治疗时,这两个羔羊分泌的乳含有大量的α1-抗胰蛋白酶( 650微克/毫升,比以前的结果,使用的转基因随机插入的高出50倍) 。
2003年6月18日,该公司做这个工作放弃了,因为从羊奶的蛋白质的提纯设施建设的伟大牺牲。净化是很重要的,因为即使在99.9 %的纯人类患者可以发展对微量,羊蛋白,剩下的抗体。

然而,另一家公司, GTC生物疗法,一直坚持下来,并在2006年6月向市场推出了人类蛋白,抗凝血酶,在欧洲赢得了初步的批准。他们的蛋白质 - 第一个在获得监管部门的批准用于人类治疗的转基因动物 - 转基因山羊的奶中分泌。
转基因鸡

增长速度比绵羊,山羊和大量在近距离可以种植;
合成一些克蛋白质中的“白”的鸡蛋。
有两种方法已成功地生产鸡携带和表达外源基因。
与病毒载体感染胚胎
人类基因治疗性蛋白
启动子序列,将响应蛋清中的蛋白质(如溶菌酶)的信号。
转化公鸡精子与人类基因及相应的发起人和检查任何转基因的后代。
这两种方法的初步结果表明,它可能是未能鸡产生高达0.1克的人类蛋白质,在每个蛋铺设。

不仅要成本低于生产治疗性蛋白在培养器皿中,但可能会增加鸡正确的糖,糖化蛋白 - 大肠杆菌不能做的东西。

转基因猪
转基因猪也已产生的正常的卵子受精的精子细胞,将外源DNA 。此程序称为精子介导的基因转移( SMGT )也许有一天能够生产转基因猪可以作为人类器官移植的来源。 [详细]

转基因灵长类动物
在5月28日2009年发行的性质,日本科学家成功建立转基因狨猴。狨猴是灵长类动物,因此我们的近亲(到目前为止) ,通过基因改造。在某些情况下,转基因(绿色荧光蛋白)被纳入种系传递到动物的后代。希望的是,这些转基因动物提供最好的模型,为研究人类疾病和可能的治疗。